细胞生物学实验教案
医学生物学教研室
实验一：细胞形态结构的观察和显微测量
教研室： 医学生物学教研室 教师姓名：
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课程名称
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细胞生物学
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专业层次
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各个本科专业
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年级
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级
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授课方式
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讲授
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授课时间
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20min
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学时
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3
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授课题目：细胞形态结构观察和显微测量
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目的要求：
1.确认光镜下细胞的形态特点。
2.初步掌握临时制片的方法。
3.学会使用测微尺及绘制生物图。
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授课内容：
1.蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞的制备5min
2.蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察5min
3.蟾蜍肝脏压片的制备与观察5min
4.蟾蜍血涂片的制备与观察5min
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重点难点：
1.不同细胞的形态特征
2.制片过程和各个步骤的时间
3.熟练应用显微镜
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教具与课件：
利用实验材料教师亲自演示
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课外作业：
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课后回忆：
细胞的形态结构是如何适应其生理功能的？
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讲授内容与过程
一．目的
1.了解光镜下细胞的形态特点。
2.初步掌握临时制片的方法。
3.学会使用测微尺及绘制生物图。
二．材料
1.动物：蟾蜍。
2.器具：显微镜、暗视野显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺、手术器材一套、解剖盘一个、注射器、载玻片、盖玻片、小平皿一个、吸管、吸水纸、牙签探针。
3.试剂：1％甲苯胺兰、0.2％次甲基兰、Ringer氏液(两栖类用)。
三．内容与方法
（一）标本的制备与观察
1.蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞的制备(不作)
操作：取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿内，用Ringer氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色10min，盖上盖片，吸去多余染液。
观察：在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。染成蓝紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁。
2.蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察
操作：剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉，放在载片上，用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌束，继续剥离，可得到很细的肌纤维(肌细胞)。尽可能拉直肌纤维。
观察：在显微镜下观察，肌细胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的周边(参照照片)。
3.蟾蜍肝脏压片的制备与观察
操作：剪开蟾蜍体腔，取一小块(约2～3mm3)肝放在平皿内，用Ringer氏液洗净，用镊子轻压将肝中的血挤出。然后放在载片上，制片方法同脊髓压片。用次甲基兰染色。
观察：显微镜下观察可见肝细胞核染成蓝色，肝细胞紧密排列，挤成多角形。
4.蟾蜍血涂片的制备与观察
操作：取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在载片上．将另一载片的一端呈45°角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层。(图l-1)。晾干。
图1—1血涂片的制备
观察：显微镜观察可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。
5.暗视野观察蟾蜍精子的鞭毛运动(不作)
操作：将前面实验所用蟾蜍沿腹中线剪开，暴露出黄色圆柱状精巢；剪取一侧精巢放置盛有自来水的平皿中，用镊子夹住精巢的一端，清洗血污；取洗净的精巢放到另一干净的平皿上，用眼科剪将精巢充分剪碎后，加入数滴自来水混匀。用吸管吸取平皿内液体，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，稍待2 min ~3 min，镜下观察。
观察：暗视野观察蟾蜍精子的鞭毛运动：低倍镜下可看到视野中有许多精子：头部呈长锥形，尾为细长的线状结构；高倍镜下，见有许多靠尾部鞭毛弯曲摆动驱使运动的精子。
6.人口腔上皮细胞标本的制备与观察(不作)
操作：用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)，滴一滴甲苯胺兰染液，染色5min，盖上盖片，吸去多余染液。
观察：显微镜下观察可见口腔表面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形核，染成蓝色。
（二）测微尺的使用
显微测微尺是用来测量细胞在显微镜下长度的工具，由目镜测微尺和镜台测微尺组成，两尺配合使用。
目镜测微尺是一个放在目镜内的圆形玻片，其玻片中央刻有一条直线，此线被分为若干等分的格，每一小格表示的实际长度随不同的显微镜、不同放大倍数的物镜而异。镜台测微尺是在一块特制的载玻片中央，由圆形盖片封固着的具有精细刻度的标尺，全长1mm，上有100等分的小格，每小格的长度为10μm（0.01mm）。在标尺的外围有一小黑环, 便于找到标尺的位置。显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格所表示的实际长度。在测量细胞时，移去镜台测微尺，换上被测标本，用目镜测微尺即可测得观察标本的实际长度。
操作方法:
1.取下目镜，将目镜测微尺的刻度面向下放入目镜内的视场光阑上，再旋上透镜。
2.将镜台测微尺盖片面朝上放在载物台上，先用低倍镜观察, 调节焦距看清镜台测微尺的刻度。
3.移动镜台测微尺，同时转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺平行，零点对齐。从“0”开始向右方找出两尺刻度重合的位置，记录各尺从重合点向左的格数。如在低倍镜下所标定的目镜测微尺的全长（50格）等于镜台测微尺68格，也就是等于0.68mm，则目镜测微尺每小格代表的长度则为0.68mm/50即为0.0136(13.6μm)。
4.以下式计算目镜测微尺每小格表示的实际长度：
目镜测微尺每小格实际长度=
镜台测微尺的若干格数/对应的目镜测微尺的格数Ⅹ10μm
5.取下镜台测微尺，换上需要测量的玻片标本，用目镜测微尺测量细胞所占小格数并乘以目镜测微尺每小格代表的实际长度，即为被测细胞的实际长度。
6.测量人口腔粘膜上皮细胞的结构。
四．注意事项
1.肌肉纤维的剥离要顺着肌纤维的方向，因此取材是要沿肌纤维截取稍长一些。
2.肝脏压片后，两张压片上都有被压碎的肝组织，为了找到更好的观察对象，最好两张压片都染色。
3.血涂片时，角度和速度一定要掌握好，可反复操作，一定要避免涂层过厚或推成搓板。
4.如果需换用高倍镜或油镜测量时,要用同样的方法重新计算高倍镜或油镜下目镜测微尺每小格的长度；在测量时要注意将被测物体放在视野中央，因为这个位置镜像最清楚，相差最小；每一种被测物体(细胞)需反复测量数个或数十个，采用其平均植。
5.穿刺法处死蟾蜍：取蟾蜍一只，左手食指和中指夹住蟾蜍前肢，无名指和小指夹住后肢，大拇指压住头部，使头和躯干呈一定角度。右手持解剖针，对准头和躯干背侧相连的凹陷处（即枕骨大孔），以穿刺法捣毁脑和脊髓。当蟾蜍四肢无力下垂时，即表明动物已死。
6.暗视野照明法的原理：它是一种使照射被捡物体的光线不直接进入物镜的照明方法。常用它观察未染色的活体细胞或胶体粒子。利用此法，在显微镜下观察时直接看不到通过标本的照明光线，而是被检物反射或衍射的光线进入物镜，可提高分辨率，在暗视野中可以看到明亮的被检物体的存在和运动，但它们的内部结构却看不清楚。
7.将自制遮光板放置滤光框上，使普通显微镜变为简单的暗视野显微镜
①将显微镜聚光器调到最高位，低倍镜下调焦至清楚。
②取下目镜，从镜筒中观察并调节光圈的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相同。
③将一块透明玻璃放置在载物台透光孔上，用标尺测量光圈孔径。
④按照图3-4的形状，用黑纸剪成与调节后光圈孔径一样大小的中央遮光板。
⑤将中央遮光板放置在显微镜的滤光框上，即可进行标本的暗视野观察。
注：如果使用高倍镜观察标本时，应按高倍镜调焦的视野大小重新制作中央遮光板。
五．作业
1.绘制肌细胞图，标明细胞膜、质、核。
2.绘制肝细胞图，标明细胞膜、质、核。
3.绘制血细胞图，标明细胞膜、质、核。
4.分别测量蟾蜍和小鼠的6个红细胞长度,取其平均值。
5.附：根据长度测量的结果，计算细胞、细胞核的体积及核值比。
圆球形V=4/3πr3(r为半径)
椭圆形V=4/3πab2(a、b为长、短半径)
核质比N/D=Vn/(Vc—Vn)(Vn为核的体积，Vc是细胞质的体积)
实验二：X染色质标本制备和观察
教研室： 医学生物学教研室 教师姓名：
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课程名称
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细胞生物学
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专业层次
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各个本科专业
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年级
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级
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授课方式
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讲授
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授课时间
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30min
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学时
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3
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授课题目：x染色质标本制备和观察
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目的要求：
1.明确X染色质的形态、数量、分布特点。
2.掌握X染色质标本制作方法。
3.认识X染色质与X染色体之间的数量关系，学会核性别的判断方法。
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授课内容：
1.实验原理10min
2.方法步骤10min
3.观察和判断10min
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重点难点：
1.Lyon假说的要点
2.制片过程
3.正确判断核性别
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教具与课件：
利用实验材料教师亲自演示
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课外作业：
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课后回忆：
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讲授内容与过程
一．目的
1.通过实验明确X染色质(X chromatin)的形态、数量、分布特点。
2.通过实验掌握X染色质标本制作方法。
3.通过实验认识X染色质与X染色体之间的数量关系，学会核性别的判断方法。
二．材料
1.器械：显微镜-观察标本；盖玻片和载玻片-制片；消毒牙签-取材；染色缸和试剂瓶-染色和固定；天平和量筒-配液；恒温水浴箱-恒温染色；白绸-清洁标本和显微镜
2.试剂 乙醇、龙胆紫、硫瑾、巴比妥钠、HCL、冰醋酸、醋酸钠、蒸馏水
三．方法和步骤
1.人口腔粘膜上皮细胞X染色质标本制备
涂片：簌口后用清洁的消毒牙签，从颊部内侧轻轻刮取少许口腔黏膜上皮细胞，均匀涂布于洁净的载玻片上。
固定：在涂片未干燥时用95%酒精固定15分钟"蒸馏水 冲洗。
染色：龙胆紫染色法：1-2分钟，用水冲洗，油镜观察。硫瑾染色法：5N Hcl（220C）中10分钟"蒸馏水冲洗"染色30分钟"用水冲洗"油镜观察。
2.人口腔粘膜上皮细胞X染色质标本观察
油镜观察"50个可数细胞"X染色质出现率
正常值：男性，低于1%；女性，高于10%。
人口腔粘膜上皮细胞（示X染色质）
四．注意事项
1.刮取口腔粘膜上皮细胞时不宜用力过大，涂片时尽量使其均匀，最好能使细胞成单层分散平铺。
2.Hcl水解掌握好时间和温度。
3.染色时间需掌握好，必要时可分别不同时间染色。
4.计数细胞时，细胞核必须完整无缺，无皱褶，染色均匀。
五．染液配制方法(学生不做)
1.龙胆紫染液配制法：冰醋酸30ml、龙胆紫0.75g、蒸馏水70ml。先加温使龙胆紫溶于冰醋酸中，晾凉后再加蒸馏水。
2.硫瑾原液配制法：硫瑾4g、50%酒精100ml。配制成100ml硫瑾液。在与缓冲液混合前过滤。
3.缓冲液配制：醋酸钠1.94g、巴比妥钠2.94g、加蒸馏水至100ml冰箱保存。
4.硫瑾工作液配制法：按下列顺序混合，饱和硫瑾100ml、0.1NHCl70ml、缓冲液60ml。调至PH5.7冰箱保存。
六．作业
1.绘出细胞X染色质图，表明细胞膜、细胞质、细胞核、X染色质四部分。
2.写出男女X染色质正常值。
实验三：细胞器（细胞骨架）的观察
教研室： 医学生物学教研室 教师姓名：
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课程名称
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细胞生物学
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专业层次
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各个本科专业
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年级
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级
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授课方式
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讲授
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授课时间
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20min
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学时
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3
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授课题目：细胞器（细胞骨架）的观察
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目的要求：
1.掌握细胞骨架的光镜临时装片标本的制作方法。
2.掌握光镜下动物细胞器的形态特征。
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授课内容：
1.实验原理5min
2.方法步骤10min
3.观察和判断5min
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重点难点：
1.细胞骨架的形态、组成
2.制片过程
3.细胞骨架的观察与辨别
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教具与课件：
利用实验材料教师演示讲授，学生亲自操作
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课外作业：
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课后回忆：
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讲授内容与过程
一．目的
1.掌握细胞骨架的光镜临时装片标本的制作方法。
2.掌握光镜下动、植细胞器的形态特征。
二．材料
1.器械：光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、培养皿、吸水纸、吸管、水浴锅。
2.试剂 6 mMol 磷酸缓冲液PBS、1% triton X-100（去垢剂）、3%戊二醛、0.2%考马斯亮兰R250染料、洋葱。
三．方法和步骤
1.取材：撕取洋葱鳞茎内表皮2-3mm2置于载玻片上，用吸管加6 mMol PBS 缓冲液两滴，使材料充分浸入到液体中，处理5-10分钟。
2.去垢处理：用吸水纸吸净浸泡材料的PBS，加2-3滴去垢剂1%Triton X-100，使液体充分浸泡材料，并立即放入37℃水浴锅中处理15分钟。
3.冲洗：吸去1%Triton，用6mMol PBS缓冲液轻轻冲洗两次，每次5分钟。
4.固定：用吸管将PBS缓冲液吸尽，加2滴3%戊二醛固定20分钟。
5.冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用6mMol PBS缓冲液冲洗两次，每次5分钟。
6.染色：吸去PBS缓冲液，滴几滴0.2%考马斯亮兰R250染料，染色10分钟。
7.制片：吸去染料，加盖盖玻片。
8.观察：将制好的片子置于光镜的低倍镜下，可见到规则排列的长方形洋葱表皮细胞轮廓，细胞内可见到被染成兰色的粗细不等的分枝状结构，这便是细胞骨架。转高倍镜继续观察，调节小镙旋可见到细胞骨架的立体结构。
四．注意事项
1.撕取洋葱鳞茎内表皮不可带茎肉。样本要展开铺平。
2.去垢处理要掌握好时间和温度。
3.染色时间需掌握好，必要时可分别不同时间染色。
4.观察时选择平展染色适中的部位观察。
五．染液配制方法(学生不做)
1.6mmol/L PBS（pH6.5）：
A液：Na2HPO4 ·2H2O 936mg/1000ml；
B液：NaH2PO4 ·12H2O 2150mg/1000ml；
工作液：A液68.5 ml + B液31.5 ml (用NaHCO3调pH至6.5)。
2.1％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶液：量取1mlTritonX-100液，加M-缓冲液99ml即可。
3.M-缓冲液配制：
眯唑(Imidazole) 3.404g
KCI 3.7g
MgCl2·6H2O 101.65mg
EGTA 380.35mg
EDTA 29.224mg
巯基乙醇 0.07ml
甘油 297ml
蒸馏水 加至1000ml
用lN HCl调pH至7.2室温保存。
4.3％戊二醛：25％戊二醛12ml、6mmol/L PBS 88ml。
5.0.2％考马斯亮蓝R250染液：考马斯亮蓝R250 0.2g、甲醇46.5ml、冰醋酸7ml加蒸馏水至100ml。
六．作业
1.绘制洋葱表皮细胞骨架图。
