生物化学实验
绪言
一.实验目的
1.加深对理论的理解，理论联系实际。
2.掌握实验的基本方法和技能。
3.培养严谨的科学态度和作风。
二.实验室规则
1.实验前需预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果、操作关键步骤及注意事项。
2.实验要严肃认真地按照操作规程进行，注意观察实验中出现的现象和结果，并把实验数据和结果及时如实记录在实验记录本上，课后根据实验结果进行科学分析。
3.实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。
4.注意节约药品、试剂和各种物品，爱护仪器，按规程操作仪器，以免损坏。如果损坏仪器照章赔偿。
5.实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。
三.实验课考核标准和考核方法
考核标准：实验课成绩占生化课总成绩的20％，共12次实验。每次实验为2分，缺课一次减2分，缺课1/3以上者，取消生化课考试资格。
考核方法：分实验过程考核和实验报告考核。
实验过程考核占1分，包括操作方法及实验结果评分。实验结果占0.4分（结果的正确度），实验操作占0.6分（包括分光光度法测试，离心机使用，层析法，电泳法等基本操作）。
实验报告考核占1分。要求书写规范，字迹清晰，结果分析合理，不允许抄袭。
实验一 基本操作
一.目的
1.熟悉实验室规则及常用生化仪器。
2.掌握各种仪器的正规操作。
3.清点洗刷实验用具。
一、 实验内容
（一） 常用生化仪器
量器：量筒、离心管、吸量管、容量瓶
玻璃仪器
容器：烧杯、试管、锥形瓶、滴管
仪器：离心机、水浴箱、电泳仪、分光光度计等
（二） 玻璃仪器的洗涤
1、初用的玻璃仪器的清洗：表面附有碱性物质，先用去污粉洗，再用自来水冲洗干净，然后浸于盐酸溶液浸泡过夜，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，80℃烤干备用。
2、使用过的玻璃仪器洗涤
（1）一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如烧杯、试管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1－2次，倒置晾干。
（2）量器，如滴定管、容量瓶等先用自来水冲洗，直至不挂水珠，再用蒸馏水冲洗1－2次，分干备用。若冲洗后仍挂水珠，则将其晾干后浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水反复冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1－2次，干燥备用。
（三）吸量管和微量移液器的使用
1.吸量管的使用（注意标签、选择容量大小合适的吸量管）
（1）正确拿法 中指和拇指拿住吸管上端，食指顶住吸量管顶端
（2）取液 用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸量管上端。
（3）调刻度 吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一水平面上。
（4）放液 吸量管移入准备接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接触器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。奥氏吸量管和刻度到底的吸量管应吹出尖端残留的液体。移液管应最后靠壁15秒。
2.微量移液器的使用
调节体积选取钮至所需值，套上吸头，旋紧。垂直持握移液器，用大拇指按下液体吸放钮至第1档，将吸头插入待吸溶液，松开大拇指使吸放钮回复原位。将移液器移入准备接受液体的仪器，用大拇指再次按下液体吸放钮，至第1档后继续至第2档以排空液体。
3.练习吸量管的使用
取50ml锥形瓶加入未知酸5ml ,酚酞指示剂1滴，摇匀，用0.01mol/LNaOH滴定，记录结果。（无色酚酞遇酸不变色，遇碱变红。）滴定时边滴边摇动锥形瓶。
(四)离心机的使用方法
离心机是利用离心力将悬浮液中的微粒从溶液中分离出来的一种仪器。根据最高离心转速的不同可将离心机分为三种类型：普通离心机，其最高转速一般在4000转/分至6000转/分；高速离心机，转速可达10000转/分至25000转/分；超速离心机，转速可超过50000转/分以上。生化实验室常使用普通离心机。
普通离心机的使用方法：
1．使用前先检查变速旋钮是否在“0”位，外套管是否完整无损和垫有橡皮垫。
2．离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量不宜过多,占管的2/3体积为宜,以免溢出。将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。
3．将一对装有离心管的外套管在台称上平衡。如不平衡可调整缓冲用水或离心物质的量。
4．将平衡好的套管，按对称方位放到离心机插孔中。把不用的离心套管取出，盖严离心机盖。
5．接通电源，开启开关，平稳、缓慢移动调速手柄，至所需转速。计时。
6．当达到离心所需时间后，将调速柄慢慢调回零位，关闭开关。待离心机自动停止转动后，再打开离心机盖取出样品。
7．用完后，取出套管中橡皮垫洗净，冲洗外套管，倒置干燥。
实验三 凝胶层析法分离蛋白质
一．目的
1．了解层析技术的基本原理；
2．初步掌握分子筛层析的原理和操作方法。
二．原理
介绍层析的概念
所谓层析，就是利用样品中各组成成分的理化性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性质等。层析系统的必要组分有：
a. 固定相，可以是一种固体、凝胶或固定化的液体
b. 层析床，把固定相填入一个玻璃或金属柱中，或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纤维纸上。
c. 流动相，起溶剂作用的液体或气体
d. 运送系统，用来促使流动相通过层析床。
e. 检测系统，用于检测试管中的物质。
由于不同物质固定相相互作用的强弱不同，从而使得分离目的得以实现。
要点：层析系统中，与固定相作用强的物质受到的阻力最大，而作用弱的物质受到的阻力很小，因而不同物质在层析过程中的迁移距离和洗脱时间不同。
介绍凝胶层析的概念。凝胶层析又称分子筛层析，主要根据混合物中分子的大小和形状不同，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。
在凝胶层析中常用的凝胶有葡聚糖凝胶(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel-P)和琼脂糖凝胶(Agarose)。葡聚糖凝胶是由细菌葡聚糖(又称右旋糖苷)在糖的长链间用交联剂1-氯-2，3-环氧丙烷交联而成。在合成时，调节葡聚糖和交联剂的比例，可以获得具有网孔大小不同的凝胶。G值表示交联度，G值愈大，交联度愈小，网孔和吸水量越大。
本实验通过SephadexG50层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，分离血红蛋白(红色，分子量约64500)与硫酸铜(蓝色，分子量249.5)的混合物，从颜色的不同可观察到血红蛋白洗脱快，硫酸铜洗脱较慢。
三．材料
1．仪器层析柱(直径0.8-1.5cm，长10-20cm)；吸管；玻璃棒；小烧杯；25ml量筒；试管。
2．试剂 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸铜溶液
四．方法
（一）凝胶的准备。由准备室制备。
（二）样品制备
1．血红蛋白(Hb)溶液的制备取抗凝血液约0.5ml于离心管中，离心5分钟(2500rpm)，弃去上层血浆，用0.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次，将血细胞用1.5ml蒸馏水稀释，即为Hb稀释液，备用。
3．取Hb稀释液与CuSO4溶液各0.5ml，充分混匀，此混合液作为样品。
（三）装柱取层析柱(直径0.8-1.5cm，长度20cm)一支，将层析柱烧结板下端的死区用蒸馏水充满，不得留有气泡，然后关闭层析柱的出口。将已溶胀的凝胶悬液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶层积集至约15cm高度即可。凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不平时，可用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，使表面平整。
（四）加样与洗脱：加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待床面上只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口。用滴管将样品(约0.4ml)小心地加到凝胶床的表面上。注意加样时不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入。然后，打开出口，使样品恰好进入床面(不要让空气进入床内)，用上法滴加1-2倍样品体积的蒸馏水，待完全流进床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直至两条区带分开为止。
注意事项：洗脱的过程中，应不断滴加蒸馏水，使始终凝胶床的上表面保留约2cm左右的蒸馏水
思考题
1. 凝胶层析法的基本原理是什么？假如分离几种分子量大于20000的蛋白质，应选用什么型的交联葡聚糖凝胶？
2. 应用本法分离血红蛋白与硫酸铜，怎样才能得到较好的分离效果？
实验四 影响酶活性的因素
（一）pH对酶活性的影响
一．目的
1．了解pH值对酶促反应速度影响。
2．掌握测定唾液淀粉酶活性的原理及定性方法。
二．原理
复习：1．酶：由活细胞产生的，对其特异底物起高效催化作用的蛋白质。
2．酶促反应：酶所催化的化学反应。
3．影响酶促反应速度的因素：[S]、[E]、pH、温度、激动剂与抑制剂
过酸过碱都能使酶蛋白变性而使其丧失活性。在不致使变性的pH值范围内，酶的活性会因pH值不同而不同。由于酶是一种蛋白质，在不同氢离子浓度下，其解离的情况不同，但往往只有一种情况下才是该酶的最高活力，此时pH值称为酶的最适pH值。倘若其作用条件偏离最适pH值任何方面，都将引起酶活性的降低，减慢酶促反应速度。
唾液淀粉酶能使淀粉水解成一系列比较简单的化合物，最终产物为麦芽糖，利用其与碘液的不同呈色反应，即可推知淀粉酶水解淀粉的程度和pH对唾液淀粉酶的活性影响，并可指出唾液粉酶的最适pH。
淀粉 紫色糊精 红色糊精 麦芽糖
(遇碘呈蓝色、遇碘呈紫色、遇碘呈红色、遇碘呈淡黄色)
三．操作方法
制备唾液：将放一薄层棉花的漏斗置于10ml量筒顶端，5名以上的学生吐1ml唾液，倒入100ml量筒中，用蒸馏水将小量筒冲洗倒入大量筒中，加蒸馏水至100ml，用吸量管混匀唾液。
取试管3支，编号，按表加各种试剂。
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编号
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0.5%淀粉液(ml)
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pH5.0缓冲液(ml)
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pH6.8缓冲液(ml)
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pH8.0缓冲液(ml)
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唾液(ml)
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1
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1
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2
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1
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2
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1
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2
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1
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3
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1
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2
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1
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摇匀放入37℃水浴中保温3分钟，用滴管吸取pH6.8管内液体一滴，在白瓷盘中用碘液检查是否水解完全，然后向各管加碘液3滴，观察结果解释之。
（二）温度对酶活性的影响
一．目的
了解温度对酶活性的影响。
二．原理
在低温时酶的催化反应速度一般很低，温度升高催化反应速度也随之升高，但酶是一种蛋白质，升高温度可以引起蛋白质的变性，使酶的活性降低。所以温度对酶的活性有二种相反的影响，一般在比较低温范围内(例如0-40℃)，温度对酶蛋白变性影响不大，活性随温度升高而增高。各种酶都有它的最适温度，此时酶表现最高的活力。机体大多数酶的最适温度在37℃—40℃。本实验利用碘与淀粉的反应，来比较唾液淀粉酶在不同温度对淀粉的水解速度。
三．操作方法
取试管4支，标号。在各管中均加入0.2%淀粉液2ml和pH6.8缓冲液1ml。然后，把第一试管置于40℃的水浴中，第二试管放在室温下，第三放在冰水中，约2分钟后，向第一、第二、第三试管再加稀释唾液1ml，第四试管加入煮沸的唾液1ml，摇匀。隔2分钟左右以第一试管取出几滴反应液至白瓷盘内，检查完全水解后，取出各管，分别加碘液1滴，观察颜色变化并解释之。
（三）激动剂与抑制剂对酶活性的影响
一．目的
了解激动剂与抑制剂对酶活性的影响。
二．原理
酶活性常受一些物质影响。在酶反应体系中加入某些物质能增高酶活性，亦即加速酶促反应的进行，而另外某些物质能降低酶的活性，即减缓甚至完全停止酶促反应的进行。前者称为激动剂，后者称为抑制剂。许多电解质是酶的激动剂，某些重金属盐则是酶的抑制剂。激动剂与抑制剂影响酶活性的需要量是很小的，并常具有特异性。本实验用氯离子和铜离子，说明对唾液淀粉酶的激动和抑制。
三．操作方法
取试管4支，编号，按表分别加入试剂，摇匀，迅速置于37℃的水浴中，15分钟后取出，冷却后分别加入碘液3滴，观察其颜色变化，并解释之。
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编号
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0.25%淀粉液(ml)
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pH6.8缓冲液(ml)
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H2O(ml)
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0.3%Nacl
(ml)
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1%CuSO4
(ml)
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唾液
(ml)
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1
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3
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1
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2
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—
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—
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—
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2
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3
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1
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1
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—
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？D
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1
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3
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3
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1
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—
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1
|
？D
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1
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4
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3
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1
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